Genetický restart – když axony znovu najdou cestu
Docentka RNDr. Pavla Jendelová, Ph.D., (Oddělení regenerace nervové tkáně, Ústav experimentální medicíny AV ČR) výsledky výzkumů popřela staletí trvající dogma, že nervová vlákna nejsou schopna regenerace.
Míšní poranění představuje devastující onemocnění, které způsobuje nevratnou ztrátu citlivosti a motorické kontroly. Incidence je asi 40 případů na milion obyvatel za rok. Přibližně za 50 % stojí automobilové nehody, čtvrtinu tvoří různé pády, pak následují sportovní úrazy. Většina pacientů zůstává podle místa poranění paraplegická nebo tetraplegická. Problém je, že axony centrálního nervového systému (CNS) se nedokážou spontánně regenerovat a v současné době neexistuje žádná léčba, která by dokázala zvrátit poškození míchy. „Pacienta lze stabilizovat, můžeme omezit zánět, určitě je důležitá rehabilitace, můžeme tlumit bolest a spasticitu. Máme různé moderní technologie, jako jsou invalidní vozíky, elektronická stimulační zařízení nebo robotický trénink chůze,“ vyjmenovala možnosti docentka Jendelová.
Když se dospělý axon učí od nezralého
Nezralý axon embryonálního spinálního interneuronu je schopen regenerace. Po přerušení distální část degeneruje, na proximální straně vlastně vyrůstá regenerovaný nový. Růstový kužel na konci axonu detekuje signály a určuje směr růstu. Cytoskelet neuronu je tvořen aktinovými vlákny a mikrotubuly, které určují pohyb a tvar kuželu. Atraktivní a repulzivní signály řídí trajektorii axonu. Kontaktní navádění kuželu je zprostředkováno přímým kontaktem s určitými molekulami, zatímco difuzní navádění funguje na principu chemického gradientu. Podpůrné gliové buňky vylučují extracelulární matrix (ECM), která tvoří skafold (lešení) pro axon. Na povrchu růstového kuželu jsou filopodia s četnými receptory. Molekulární naváděcí systémy jsou zastoupeny především integriny, které zaručují adhezi buňky k substrátu a stabilizují růst. Integriny jsou ukotveny v buněčné membráně a mohou být v neaktivní formě a teprve poté, co zevnitř buňky přijde aktivační signál, začnou integriny vázat molekuly ECM.
Růstový kužel neustále komunikuje s tělem buňky, kde probíhají změny na úrovni DNA, RNA a která může být značně vzdálena, například u spinálního motoneuronu až desítky centimetrů. V těle buňky dochází k produkci receptorů, které jsou transportovány dlouhým axonem do růstového kuželu. Receptor se exprimuje na membráně a naváže se na něj patřičný ligand, což spustí zpětnou signalizaci. V reakci začne buňka produkovat molekuly a proteiny podle toho, co potřebuje. Regenerace selhává v důsledku přerušení tohoto cyklu a pod vlivem inhibičního prostředí.
Jak můžeme obnovit přirozenou regenerační schopnost?
„Domníváme se, že pokud dokážeme exprimovat správné molekuly a dostaneme je na správné místo, třeba do růstového kuželu, potom tyto molekuly budou vysílat zpátky správné signály a axony zregenerují,“ řekla docentka Jendelová.
Další otázkou je, které jsou ty potřebné molekuly. Hlavním glykoproteinem, tedy hlavní molekulou ECM v CNS, je tenascin. Tenascin C se významně hromadí v oblasti poranění, tedy kolem léze. Dospělé neurony CNS však nemají receptory, které by se na tento tenascin vázaly. Uvedené receptory jsou na neuronech pouze v embryonálním stadiu a časem se ztrácejí.
Budou axony regenerovat, budou‑li mít na svém povrchu správné integrinové receptory? Dokáží senzorické neurony transportovat integriny do svých výběžků?
Pro první studie byly vybrány senzorické neurony, protože jsou na pomezí schopností regenerovat a neregenerovat. Jde o bipolární buňku, která jeden výběžek posílá do periferie, přičemž periferní axony jsou schopny regenerace, ale druhá část, která směřuje do CNS, už regenerovat neumí.
Zhruba před 10 lety začaly v Cambridge první experimenty, při nichž byl u potkana poškozen zadní kořen, jímž vedou senzorická vlákna do míchy. Těla senzorických neuronů sídlící v dorzálních gangliích byla injikována virovými vektory, které nesly jak gen pro α9 integrinový receptor (receptor pro tenascin), tak jeho aktivátor kindlin‑1. Tyto senzorické neurony dokázaly zregenerovat své poškozené dorzální kořeny a vrůstat do míchy. To znamená, že transport je u dospělých neuronů pro tento typ receptorů zachován [1].
„To byl vlastně začátek našich experimentů, na jehož základě jsme vytvořili vlastní projekt,“ uvedla docentka Jendelová.
Jedné skupině potkanů byly poraněny dorzální sloupce v oblasti C4 a druhé skupině v oblasti Th10. Pod místa poranění do dorzálních ganglií (C6/7 a L4/5) byly aplikovány virové vektory, které nesly receptor integrin α9 a jeho aktivátor. Zvířata 12 týdnů přežívala a po celou tu dobu byla testována různými senzorickými podněty. Nakonec byly elektricky stimulovány nervus medianus a nervus ischiadicus. Následně byla tkáň zpracována histologicky a vyhodnocena [2]. „Zajímalo nás, kolik buněk ze senzorických neuronů jsme schopni nakazit virovými vektory, jaká je účinnost transdukce,“ komentovala docentka Jendelová.
Úspěšnost transdukce byla asi 20–25 %, to znamená, že asi čtvrtina senzorických neuronů byla nakažena oběma virovými vektory. V experimentu se potvrdilo, že je možné transdukovat všechny tři typy senzorických neuronů: mechanoreceptory, nociceptory i termoreceptory. Regenerované axony prorostly okolo místa léze v provazcích vazivové tkáně bohaté na tenascin C a pokračovaly v růstu do prodloužené míchy. Cestou tvořily kolaterály do šedé hmoty. Nevrůstaly však do senzorických jader, což si tým vědců vysvětluje vysoce inhibičním prostředím jader pro axony. Vzdálenost, kterou urazily od místa léze, je 4–5 cm, což se rovná velikosti lidského poranění.
V kontrolních skupinách (bez léčby a s aplikací samotného kindlinu) axony zůstaly pod místem lézí a postupně se retrahovaly. Nedošlo k interakci neuronů s molekulami ECM. K průkazu, že šlo o úplné přerušení provazců, nikoliv jen částečnou lézi, bylo použito barvení astrocytů, které v místě vazivových provazců nebyly detekovány.
Abstrakt publikované práce
Studie se zabývala expresí adhezní molekuly integrinu α9 spolu s jejím aktivátorem kindlinem‑1 v senzorických neuronech prostřednictvím vektorů adeno‑asociovaných virů (AAV) [2]. To umožnilo senzorickým axonům regenerovat po poranění míchy a rozšířit se do mozkového kmene, čímž se obnovily senzorické dráhy, hmatové vnímání a senzorické chování.
Jedním z ligandů integrinu v poraněné míše je tenascin C, který slouží jako substrát pro integrin α9β1, klíčový receptor pro navádění axonů během vývoje. Dospělé neurony periferní nervové soustavy (PNS) a CNS však tento receptor postrádají. Senzorické neurony byly transdukovány integrinem α9 (který se páruje s endogenním β1 za vzniku receptoru pro tenascin α9β1) spolu s aktivátorem integrinu kindlinem‑1. Regenerace senzorických neuronů transdukovaných integrinem α9 a kindlinem‑1 byla zkoumána po lézích dorzálních sloupců C4 a T10 pomocí vektorů AAV1 injikovaných do senzorických ganglií C6/7 a L4/5.
U zvířat léčených integrinem α9 a kindlinem‑1 senzorické axony regenerovaly prostřednictvím řetězců a můstků pojivové tkáně exprimujících tenascin C v oblasti léze a poté znovu vstoupily do tkáně CNS. Mnoho axonů regenerovalo rostrálně na úroveň prodloužené míchy. Axony prorůstaly dorzální šedou hmotou spíše než svou normální cestou dorzálními sloupci. Růst byl pomalý, axonům trvalo 12 týdnů, než vyrostly z T10 do prodloužené míchy, což je vzdálenost 4–5 cm. Funkční zotavení bylo potvrzeno aktivací proteinu cFos v neuronech rostrálně od poranění po nervové stimulaci a barvením VGLUT1/2, což naznačuje tvorbu nových synapsí nad lézí. Zotavení chování bylo pozorováno jak v tepelném, tak v mechanickém vnímání i v testu odstranění lepicí pásky (léčený se je snažil sundat, neléčený byl netečný). Tento přístup demonstruje potenciál terapií založených na integrinech pro regeneraci senzorických axonů na dlouhé vzdálenosti a funkční obnovu po poranění hrudní a částečnou obnovu po poranění krční míchy.
Je možná regenerace kortikospinálního traktu?
„Svatým grálem by byla regenerace motorické kortikospinální dráhy se specializovanými axony, které ztratily schopnost transportovat integrin do svého růstového kuželu,“ uvedla další problematiku docentka Jendelová. Existuje však signální dráha, která se zapojuje při růstu. Fosfoinositol‑3‑kináza (PI3K) je důležitá signální molekula pro růst axonů ve vyvíjejícím se a regenerujícím nervovém systému a je vysoce zastoupena v růstovém kuželu v průběhu vývoje. S dospíváním neuronu však mizí. Výsledek experimentální práce s aplikací PI3Kδ do kortikálních motoneuronů k regeneraci kortikospinálního traktu (CST) shrnuje níže uvedený abstrakt citované práce [3].
Abstrakt citované práce
Neurony v CNS ztrácejí s dospíváním regenerační potenciál, což vede k minimálnímu opětovnému růstu axonů CST po poranění míchy. U mladých hlodavců knockdown PTEN, který antagonizuje signalizaci PI3K hydrolýzou PIP3, podporuje regeneraci axonů po poranění míchy. Tento účinek se však u dospělých snižuje, pravděpodobně v důsledku nižší aktivace PI3K, což vede ke snížené hodnotě PIP3. Tato studie zkoumá, zda zvýšená tvorba PIP3 může u dospělých podpořit regeneraci na dlouhé vzdálenosti. Použili jsme hyperaktivní PI3K, PI3Kδ (PIK3CD) ke zvýšení koncentrací PIP3 ve zralých kortikálních neuronech a hodnotili jsme regeneraci CST po poranění míchy. Dospělí potkani dostali injekcí AAV1‑PIK3CD a AAV1‑eGFP nebo samotný AAV1‑eGFP do senzomotorické kůry, současně byla provedena léze CST v oblasti C4. Transdukované neurony vykazovaly zvýšené koncentrace pS6, což naznačuje zvýšenou signalizaci PI3K/Akt/mTOR. Regenerace CST, potvrzená retrográdním značením, byla hodnocena až 16 týdnů po poranění. Po 12 týdnech bylo v místě léze přítomno přibližně 100 axonů, přičemž do 16 týdnů se jejich počet zdvojnásobil na 200 s indexy regenerace 0,1, respektive 0,2. Behaviorální testy prokázaly u potkanů léčených PIK3CD významné zlepšení v testu dosahu tlapky (jemná motorika), síle úchopu a chůzi po žebříku, což bylo potvrzeno elektrofyziologickými záznamy potenciálů z dorzální míchy a elektromyografií distálního flexorového svalu. Zvýšená regulace PI3Kδ v dospělých kortikálních neuronech tedy zvyšuje regeneraci axonů a funkční zotavení po míšním poranění [3].
Co bude následovat ve výzkumu neuroregenerace?
Použití metody exprese integrinů i v chronickém stadiu míšního poranění nebo kontuzním modelu? Jak dostat integriny do axonů motorických drah? Možnost výplně kavity míšního poranění biomateriálem, který by simuloval molekuly tenascinu C?
Závěrem docentka Jendelová shrnula:
- Genová terapie zprostředkovaná AAV s integrinem α9 a kindlinem‑1 vede k regeneraci senzorických funkcí po míšním poranění na úrovni C4 a T10, což bylo prokázáno behaviorálními testy a imunohistochemickým barvením.
- Nadměrná exprese PI3Kδ v kortikálních motorických neuronech vede k robustní regeneraci axonů, která má za následek obnovení funkce předních tlapek.
Literatura
[1] Cheah M, Andrews MR, Chew DJ, et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long‑Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci 2016; 36: 7283–7297.
[2] Stepankova K, Smejkalova B, Machova Urdzikova L, et al. Activated alpha 9 integrin expression enables sensory pathway reconstruction after spinal cord injury. Acta Neuropathol Commun 2025; 13: 89.
[3] Karova K, Polcanova Z, Knight L, et al. Hyperactive delta isoform of PI3 kinase enables long‑distance regeneration of adult rat corticospinal tract. Mol Ther 2025; 33: 752–770.