Znovuzrození neuronů: jak mozek hledá druhý dech
Gliové buňky v regeneraci nervové tkáně po cévní mozkové příhodě
Mgr. Ján Kriška, Ph.D., (Oddělení buněčné neurofyziologie, Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.) zahájil svou prezentaci netradičním „take home message“: Neurogeneze probíhá i v dospělosti a existují i gliové buňky, například NG2 glie. Celá jeho prezentace vyvrací zažitou domněnku, že dospělý lidský mozek má jednou provždy daný počet neuronů bez možnosti reparace a regenerace. Za klíčové buňky v tomto smyslu označil neurální kmenové buňky a NG2 glie, které mohou mít neurogenní potenciál.
Mozek představuje asi 2 % tělesné hmotnosti, ale využívá více než 20 % energie a spotřebuje 20 % přijatého kyslíku. Kromě asi 86 miliard nervových buněk obsahuje podle některých zdrojů i podobný počet gliových buněk, které se dělí do několika skupin [1]:
- mikroglie s imunitní úlohou (součást imunitního systému),
- oligodendrocyty tvořící myelin,
- astrocyty s mnoha funkcemi: strukturální (teritoriální seskupení), vaskulární (tvoří hematoencefalickou bariéru) a metabolické (vyživují neurony); udržují homeostázu iontů a vody (vytvářejí syncytia), glutamátu (cyklus glutamát‑glutamin) a pH; produkce antioxidantů,
- NG2 glie (polydendrocyty) exprimující NG2 protein známý také jako chondroitin sulfát proteoglykan 4 (CSPG4) vznikají z neurálních kmenových buněk v různých oblastech embryonálního mozku, jsou prekurzory oligodendrocytů.
Kromě neuronů a gliových buněk jsou nedílnou součástí centrálního nervového systému i neurální kmenové a progenitorové buňky, které se v dospělém věku nacházejí kolem centrálního míšního kanálku a v neurogenních zónách mozku: subgranulární zóně gyrus dentatus v hipokampu a subventrikulární zóně postranních komor.
Ischemie
Cévní mozková příhoda (CMP, fokální mozková ischemie) patří mezi nejčastější příčiny úmrtí v moderní společnosti. Poškozená tkáň (léze) se dělí na ischemické jádro (nevratně poškozená tkáň) a penumbru – ohroženou, ale zachranitelnou tkáň. Buněčná smrt postihne nejdříve neurony a oligodendrocyty, tedy buňky s největšími energetickými nároky. Nedostatek energie při ischemii vede ke změně iontových gradientů, k průniku vápenatých iontů do buňky a k uvolnění glutamátu, jehož vazba na glutamátové receptory na neuronech ještě zvyšuje propustnost pro vápenaté ionty, což v konečném důsledku vede k zániku buňky. Astrocyty při ischemii proliferují a hypertrofují (reaktivní glióza) a v konečném stadiu vytvoří gliovou jizvu.
NG2 glie (rozptýlené v celém mozku) v reakci na ischemii proliferují a migrují na místo poškození, hypertrofují a mění se na oligodendrocyty. Podobně reagují i kmenové a progenitorové buňky (přítomné v neurogenních zónách) a následně se diferencují do neuronů a gliových buněk.
Laboratorní metody
V modelu CMP se používají především myši, které lze geneticky modifikovat pro specifické účely. Cre/lox systém (rekombinace DNA pomocí rekombinázy Cre) umožňuje vytvořit myší kmen, u něhož lze zobrazit protein Tomato v buňkách exprimujících gen Cspg4 (pro NG2 protein). Rekombinace DNA se indukuje tamoxifenem (váže se na estrogenové receptory Cre/lox systému), kdy rekombináza Cre vstupuje do jádra buněk a z DNA „vystřihne“ sekvenci, která brání v produkci proteinu Tomato v buňkách exprimujících gen Cspg4.
Ve zvířecím modelu se nasimuluje ischemická CMP a v odebraných tkáních se provádí analýza exprese genů (PCR, sekvenace). Následují bioinformatická analýza a validace výsledků pomocí identifikace proteinů (imunohistochemicky). Funkční analýzu lze provést metodou terčíkového zámku, která, mimo jiné, identifikuje také buněčné typy.
Výzkum
Neurální kmenové a progenitorové buňky lze stimulovat k dalšímu vývoji pomocí aktivace Wingless/Integrated (Wnt) signalizace. Signální dráha Wnt/β‑katenin funguje jako faktor podporující neurogenezi. Hyperaktivace Wnt signalizace zvýšila množství proliferujících a neuronům podobných buněk, zatímco inhibice Wnt dráhy měla opačný účinek. Profilování genové exprese na úrovni jednotlivých buněk nakonec odhalilo zvýšený podíl neurálních kmenových buněk a neuroblastů po CMP. Tato pozorování naznačují, že Wnt signalizace zvyšuje regeneraci založenou na neurálních kmenových a progenitorových buňkách v mozku dospělých myší po fokální cerebrální ischemii a podporuje neuronální diferenciaci v subventrikulární zóně.
NG2 glie vykazují široký proliferační a diferenciační potenciál především za patologických podmínek. Profilování genové exprese (PCR) ukázalo, že NG2 glie mají čtyři subpopulace: NG2 glie S1, NG2 glie S2, astrocytům podobné NG2 glie (exprimující GFAP) a oligodendrocytům podobné NG2 glie. Subpopulace NG2 glie exprimující GFAP, marker reaktivních astrocytů, je po CMP přítomna pouze přechodně. Avšak po méně závažných anebo chronických poraněních, konkrétně po kortikální bodné ráně a při demyelinizaci, výrazně převažují subpopulace odrážející různé fáze zrání oligodendrocytů. Na poranění závislý výskyt odlišných subpopulací byl potvrzen také imunohistochemicky. Pro detailnější charakterizaci této jedinečné subpopulace astrocytům podobné glie bylo použito sekvenování RNA na úrovni jednotlivých buněk a pro odhalení jejich základních membránových vlastností byla použita metoda terčíkového zámku. Astrocytům podobné NG2 glie jsou specifickou subpopulací NG2 glií, která se přechodně objevuje pouze po ischemii. Astrocytům podobné NG2 glie mohou hrát důležitou roli v procesech tvorby a opravy gliové jizvy po ischemii [2].
V další studii byla zkoumána role NG2 glie v mozku dospělých myší po CMP. Zde bylo rozlišeno dokonce pět subpopulací NG2 glie, které byly přítomny také ve zdravé kůře a jejichž přítomnost, distribuce a exprese několika markerových genů se po CMP změnily. Kromě buněk reprezentujících oligodendrocytární linii byla identifikovaná subpopulace dříve popsána jako „astrocytům podobná NG2 glie“, která nyní rovněž vykazovala charakteristiky podobné neurálním progenitorům. Na rozdíl od předchozích studií byl tento typ buněk detekován i ve zdravé tkáni, ale jejich genová exprese se výrazně lišila od exprese v ischemické kůře, zejména kvůli absenci exprese GFAP v NG2 glii zdravého mozku. Je zajímavé, že během kortikální regenerace po CMP bylo v NG2 glii exprimováno několik genů spojených s neurogenezí. Nakonec byly v poraněné oblasti za 28 a 60 dní po ischemii detekovány nečetné buňky s markerem zralých neuronů, pravděpodobně odvozené z NG2 glie. Imunohistochemická analýza potvrdila expresi neurogenních markerů a ukázala zvýšenou přítomnost NG2 glií pozitivních na protein 4 Purkyňových buněk na periferii ischemické léze 12 dní po CMP, stejně jako NeuN‑pozitivních NG2 glií 28 a 60 dní po poranění. Tyto výsledky naznačují potenciální vývoj neuronům podobných buněk vznikajících z NG2 glie v ischemické tkáni. Studie poskytuje vhled do plasticity NG2 glií a jejich schopnosti neurogeneze po CMP [3].
Problémy s neurogenezí v CNS
Podle práce Androviče [4] a dalších dostupných zdrojů dochází při stárnutí ke snižování neurogenního potenciálu buněk. Reakce na CMP v mladém a starším mozku je podobná, ale liší se rozsahem a u starších myší po CMP je snížena regulace „axonálního a synaptického údržbového programu“. Kromě toho se v CNS projevují inhibiční vlastnosti proteinu CSPG4 a gliové jizvy a skutečnosti, že ischemie aktivuje glie především v akutní fázi a mikroprostředí mozku mimo neurogenní zóny inhibuje neurogenezi.
V uvedené studii se autoři zaměřili na analýzu interakce mezi CMP a stárnutím na úrovni celého genomu. Byl použit model CMP (permanentní okluze střední mozkové tepny) u mladých dospělých (3 měsíce) a starých (18 měsíců) samic myší a analyzována postischemická kůra tři dny po CMP pomocí sekvenování RNA. Výsledky ukazují na změny v procesech převážně spojených se zánětem a interferonovou signalizací závislé na věku, jakož i propojené s udržováním axonů a synaptického nervového systému. Výsledky byly poté doplněny cílenou analýzou exprese na akutně izolovaných buněčných populacích a poskytly podrobný vhled do časové dynamiky a buněčně specifické odpovědi interferonové signální dráhy v mladém a starém postischemickém mozku. Autoři odhalují downregulaci genetického programu pro udržování axonů a synapsí a zvýšenou aktivaci signalizace interferonu typu I (IFN‑I) po CMP u starých myší.
V recentní (zatím nepublikované) práci bylo zjištěno, že hyperaktivace Wnt signalizace blokuje zrání oligodendrocytů a narušuje začlenění NG2 glie do ischemické jizvy. Podporuje aktivace Wnt signalizace také neurogenní vlastnosti glií? „Možným vysvětlením je, že aktivace Wnt signalizace dává na vědomí NG2 gliím, aby se věnovaly jiným aktivitám,“ domnívá se doktor Kriška. Možná se časem prokáže, že jde o neurogenní aktivitu. Pro toto tvrzení zatím neexistují data.
Závěrem
V závěru prezentace se doktor Kriška dotkl léčby spinální svalové atrofie. Možná léčba nusinersenem funguje na principu vyzrávání (nedozrálých) neuronů.
V diskusi docentka Haberlová uvedla, že je již prokázáno, že u spinální svalové atrofie jde o poruchu vyzrávání motoneuronů a tvorby synapsí. SMA není neurodegenerativní onemocnění, ale vývojová odchylka.
Literatura
[1] Goriely A. Eighty‑six billion and counting: do we know the number of neurons in the human brain? Brain 2025; 148: 689–691.
[2] Kirdajova D, Valihrach L, Valny M, et al. Transient astrocyte‑like NG2 glia subpopulation emerges solely following permanent brain ischemia. Glia 2021; 69: 2658–2681.
[3] Janeckova L, Knotek T, Kriska J, et al. Astrocyte‑like subpopulation of NG2 glia in the adult mouse cortex exhibits characteristics of neural progenitor cells. Glia 2024; 72: 245–273.
[4] Androvic P, Kirdajova D, Tureckova J, et al. Decoding the Transcriptional Response to Ischemic Stroke in Young and Aged Mouse Brain. Cell Rep 2020; 31: 107777.