Od transfuze ke genové imunoterapii – historie léčivých přípravků moderní terapie a jejich regulace

Souhrn:
Lesný P. Od transfuze ke genové imunoterapii – historie léčivých přípravků moderní terapie a jejich regulace. Remedia 2019; 29: 556–558.
Významnou součástí současné medicíny jsou léčivé přípravky moderní terapie připravované úpravami genotypu a/nebo fenotypu vlastních buněk pacienta nebo buněk dárce. Historie terapeutického využití krevních složek sahá až k počátkům transfuzní medicíny a k prvním experimentům s transfuzemi. Navazující výzkum pak pomohl nalézt metody pro přesnější oddělení jednotlivých krevních elementů a jejich aplikaci v imunoterapii. Nové objevy a na ně navazující potřeba státních regulací léčebného využití buněk izolovaných z krve představují pak důležitou součást moderní hematoonkologie.

Summary:
Lesny P. From transfusion to gene immunotherapy – the history of modern medical products and their regulation. Remedia 2019; 29: 556–558.
Modern medicinal products prepared by manipulating genotype and/or phenotype of cells from a patient or a donor represent an important part of contemporary medicine. The history of therapeutic utilization of blood components reaches as far as the origins of transfusion medicine and the first experiments with transfusions. Subsequent research helped with developing methods for more precise separation of indivdual blood components and their application in immunotherapy. New findings and the related need for state regulation of medicinal usage of cells isolated from blood represent an important part of modern hematooncology.

Key words: transfusion medicine,  hematooncology, apheresis, immunomagnetic separation, gene immunotherapy

 Úvod a počátky transfuzního lékařství

Poté, co William Harvey objevil v 17. století krevní oběh a popsal jeho význam, se začaly v řadě zemí objevovat pokusy léčit krevní ztráty nitrožilním podáním krve jiného člověka (nebo zvířete) a byly položeny základy transfuzní medicíny. Počátky transfuzního lékařství byly dobou experimentů, na které dnes shlížíme s úsměvem: nitrožilně byla podávána zvířecí krev člověku (1667, Jean Baptiste Denis), krátce bylo experimentováno se zvířecími mléky jako náhražkou krve (1884) nebo byla propojována tepna dárce přímo s žílou příjemce (1829, Blundell). Série objevů, k nimž došlo koncem 19. století, zejména pak objev krevních skupin (1900, Karl Landsteiner) a objev protisrážlivých vlastností citronanu sodného (1914 současně Hustin, Lewisohn a Agote), umožnila na počátku 20. století významně zvýšit úspěšnost transfuzní léčby. Na konci první světové války už ve světě nacházíme prakticky použitelnou transfuzní léčbu krevních ztrát, která zahrnovala křížové testy, antikoagulancia a skladování krve při nízkých teplotách [1].

První využití transfuzí nastalo v léčbě ztrát krve a krvácivých poruch a přenášeny byly erytrocyty; již od počátku bylo však jasné, že role jednotlivých krevních elementů, zejména bílých krvinek, je mnohem složitější. Na konci 19. století byly diagnostikovány první leukemie ‒ jednalo se o systematické popisy pacientů s abnormálně vysokými počty bílých krvinek a krví, která připomínala hnisavé výpotky (1854 současně Virchow a Bennett). Nedlouho poté byl objasněn význam trombocytů, třetí popsané složky krve (1882, Bizzozero) pro trombózu a hemostázu. V roce 1957 byly položeny buněčné základy pro transplantaci kostní dřeně v léčbě leukemií (1957, Don Thomas) a pozornost se pomalu začala upírat na jednotlivé složky krve a jejich cílené využití v léčbě, zejména hematoonkologických onemocnění [2].

Tradiční rozdělení v té době bylo na transplantace (pevných orgánů) a transfuze (krve). V roce 1952 byl v ČR pro výzkum směřující k zajištění plynulého provozu transfuzní služby založen Výzkumný ústav hematologie a krevní transfuze, k němuž v roce 1955 přibylo lůžkové oddělení a v roce 1976 jednotka intenzivní péče, kde byli léčeni pacienti s akutními leukemiemi.

Aferéza

Při hledání metod, jak od sebe oddělovat jednotlivé krevní elementy, se nejprve používaly metody fyzikální, zejména gradientová centrifugace (urychlená sedimentace), která umožňovala poměrně rychle separovat plazmu, červené krvinky a vrstvu leukocytů. Hematologické analyzátory (1954, Wallace H. Coulter) využívaly to, co dnes označujeme jako Coulterův princip (buňky procházely malým otvorem, v němž byla měřena impedance) k určení velikosti bílých krvinek a rozdělení na lymfocyty, monocyty a granulocyty [3]. Proces však byl příliš pomalý pro praktické oddělení buněčných populací třeba před transplantací. Obdobně bylo v diagnostice od sedmdesátých let využíváno fluorescenčně aktivované třídění buněk, které umožňovalo přesné oddělení značených buněk ze suspenze, rychlost procesu však omezila tuto technologii na laboratorní a výzkumné použití.

Objev přístroje pro aferézu krevních složek pracujícího na principu průběžné centrifugace krve procházející přístrojem (1972, Herb Cullis) umožnil získávat od dárců poměrně přesně a rychle separované požadované krevní elementy. Do přístroje pro aferézu (separátoru) vstupuje plná krev dárce, centrifugací je z ní odebírána požadovaná složka v závislosti na specifické hmotnosti (plazma, erytrocyty, mo­no­nuk­leár­ní buňky apod.) a zbývající složky krve se vracejí zpět dárci. Terapeutická hemaferéza je léčebný výkon, jehož cílem je snížení počtu zmnožených krevních elementů v cirkulaci nemocného, případně snížení obsahu patogenních komponent v plazmě. Dárcovská hemaferéza slouží k získání příslušné krevní složky od dárce za účelem jejího dalšího využití [4].

V roce 1993 byl popsán účinek růstového faktoru (faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů, granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM CSF) na mobilizaci kmenových buněk z kostní dřeně do periferní krve [5], odkud je možné je izolovat pomocí aferézy ‒ aferéza leukocytů je označována jako leukaferéza. Transplantace kmenových (progenitorových) buněk z periferní krve (peripheral blood progenitor cell, PBPC) začala pomalu vytlačovat transplantace kostní dřeně nejprve v modelu autologním ‒ použití u stejného pacienta, u kterého byla odebrána, ‒ a později v modelu alogenním ‒ použití u jiného pacienta. Dnes je nejčastější transplantace štěpu od haploidentického příbuzného dárce, tedy se shodnou polovinou znaků lidského leukocytárního antigenu.

Imunomagnetická separace, regulace lidských tkání a buněk

Průlom v možnosti terapeuticky využít jednotlivé podtypy buněk z periferní krve přišel v roce 1990 jako magneticky aktivované třídění buněk (1990, Stefan Miltenyi) [6]. Tato technologie využívá protilátky s pevně připojenými superparamagnetickými kuličkami velikosti 100 nanometrů, které se vážou na příslušné antigeny na povrchu buněk. Buňky s navázanými magnetickými kuličkami pak jsou zadrženy silným magnetem. Imunomagnetické třídění je možné využít nejen k odstranění značených buněk ze suspenze pomocí magnetu, ale i k pozitivnímu výběru (obohacení), při němž jsou značené buňky magnetickým polem zadrženy v koloně promývané buněčnou suspenzí a po vypnutí magnetického pole se tyto buňky uvolní z kolony do média. Pro využití této technologie v léčbě začala společnost Miltenyi Biotec prodávat přístroj CliniMACS, který umožňoval jednoduše použít imunomagnetické třídění v hematologické praxi.

Okamžité aplikace technologie imunomagnetické separace zahrnovaly obohacení štěpu získaného z periferní krve o populaci hematopoetických kmenových buněk (nesoucí povrchový znak CD34 [7]), nebo odstranění populace – depleci ‒ T lymfocytů odpovědných za reakci štěpu proti hostiteli (odstranění buněk nesoucích T buněčný receptor – CD3). Pro prevenci reakce štěpu proti hostiteli, která zůstává jedním z hlavních nežádoucích účinků přenosu imunitně aktivních buněk (lymfocytů), byly v klinickém výzkumu využívány populace T regulačních buněk nebo T buněk s gama delta receptory.

Nové možnosti selekce buněk pro transplantaci v hematoonkologii sledovaly regulační orgány, které zpočátku považovaly jednotlivé postupy pro získávání subpopulací krevních buněk za varianty transfuze. V roce 2004 však Evropská unie jasně vymezila rozdíl mezi transplantací (například pevných orgánů), zpracováním krevních derivátů (transfuze) a izolovanými buňkami používanými k léčbě, pro které byl zaveden úřední termín „lidské tkáně a buňky“. Příslušné nařízení pak zavádělo standardy v darování, odběru, zpracování a léčebném použití lidských tkání a buněk, kam byly řazeny i jednotlivé separované buněčné populace.

Pravděpodobně nejsofistikovanější technologií tohoto typu byla metoda umožňující oddělit z krve dárce pomocí imunomagnetické separace T lymfocyty selektivně rozeznávající vybraný antigen (například cytomegalovirus nebo virus Epsteina‒Barrové) [8].

Od lidských tkání a buněk k imunoterapii

Vývoj v oboru pokračoval a možnost oddělovat populace buněk z periferní krve a kostní dřeně byla záhy rozšířena o buněčnou kultivaci. Vybrané populace buněk se po odběru začaly ve vhodných podmínkách množit, a dokonce bylo možné začít měnit jejich vlastnosti působením vhodných růstových faktorů v prostředí in vitro. Klasickými příklady takto in vitro expandovaných buněk izolovaných z periferní krve použitých v klinických studiích jsou mezenchymální kmenové buňky, dendritické buňky a tzv. přirození zabíječi (natural killer cells, NK buňky).

Multipotentní mezenchymální kmenové buňky (mesenchymal stem cells, MSC) představují populaci buněk kostní dřeně, která nevytváří krevní elementy, je však schopna se diferencovat na široké spektrum (mezodermálních) buněčných typů: například na buňku tukové tkáně, kosti nebo chrupavky. Mezenchymální kmenové buňky mají výrazné imunomodulační účinky a v kostní dřeni vytvářejí vhodné prostředí pro hemopoezu. Působením GM CSF se z kostní dřeně určitý podíl těchto buněk uvolní a koluje v periferní krvi, odkud je možné zachytit je aferézou a následně oddělit od ostatních buněk na základě jejich obliby pro růst na určitých typech plastu [9]. Pokud je pak in vitro namnožíme a podáme pacientovi, jsou schopny vyvolat poměrně rozsáhlou systémovou imunosupresi (zejména jejich tzv. imunosupresivní fenotyp). Pomineme li jejich použití v regenerativní medicíně, jsou tyto buňky dnes využívány v hematoonkologii k léčbě reakce štěpu proti hostiteli, která nereaguje na kortikoidy [10].

Dendritické buňky jsou schopny v těle rozeznat patogenní či nebezpečné signály, fagocytovat částice nesoucí „podezřelé“ antigeny a prezentovat tyto antigeny na membráně naivním T lymfocytům spolu s expresí různých kostimulačních molekul a cytokinů, jimiž je nastartována imunitní reakce. Dendritické buňky je možné izolovat z periferní krve, poměrně snadno namnožit a in vitro vystavit požadovanému antigenu ‒ například rozštěpeným nádorovým buňkám. Působením vhodných spouštěčů (např. interferonu gama) pak dendritická buňka „vyzraje“ a ponechá si na membráně příslušné antigeny. Pokud tyto buňky transplantujeme zpět pacientovi, můžeme v některých případech nastartovat nebo urychlit imunitní reakci na nádor [11].

Přirození zabíječi jsou jedním z hlavních nástrojů nespecifické imunity. Tyto buňky pomocí svých povrchových receptorů rozeznávají aktivační a inhibiční signály na buňkách ve svém okolí. Pokud se rovnováha vychýlí na stranu aktivace, uvolní NK buňka granula s cytolytickými enzymy. Za přítomnosti vhodných cytokinů je možné NK buňky izolované z periferní krve (kterých jsou za normálních okolností zlomky procent) oddělit pomocí imunomagnetické separace a na­mno­žit [12]. Tyto buňky se pak mohou po transplantaci aktivovat v přítomnosti nádorů a spouštět jejich cytolýzu. Obdobným způsobem jsou používány T buňky s gama delta T buněčnými receptory [13]; ani jeden z buněčných typů za normálních okolností nezpůsobuje reakci štěpu proti hostiteli.

Zavedené rozdělení na transplantace (pevných tkání), transfuze (krevních složek) a přenos lidských tkání a buněk (všechno ostatní) najednou celosvětově přestávalo regulačním orgánům stačit. Nebylo jasné, zda třeba využití kmenových buněk kostní dřeně patří do transplantace, přenosu lidských tkání a buněk, nebo transfuze. Procesy pro manipulaci s buňkami, jejich in vitro expanzi a stimulaci byly stále komplikovanější a panovaly obavy z toho, že regulační autority nebudou schopny včas postihnout novinky ve výzkumu a správně hodnotit bezpečnost a efektivitu podávaných buněčných přípravků. V roce 2007 tak Evropská léková agentura (EMA) vytvořila definici „léčivých přípravků pro moderní terapie“ a do roku 2009 uložila všem členským státům zajistit, že jejich veškerý výzkum, klinické hodnocení a podávání pacientům budou odpovídat pravidlům pro léčivé přípravky ‒ tedy nejpřísnější v té době známé legislativě.

Vzniklou úpravu již známe ze současnosti. Rozeznávány jsou transplantace (přenos orgánu nebo tkáně s účelem nahradit jeho funkci), transfuze (přenos plné krve nebo jejích složek), manipulace s lidskými tkáněmi a buňkami (tam, kde jsou přenášeny buňky nebo tkáně jen minimálně zpracované ‒ povoleno je např. zmrazení nebo jednoduchá imunomagnetická separace) a léčivé přípravky pro moderní terapie (sem je řazeno veškeré využití buněčných populací, které podstoupily podstatnou manipulaci, jež mohla změnit jejich vlastnosti). Cíle těchto velmi přísných legislativních úprav bylo v rámci Evropské unie dosaženo a možná rizika pro pacienty byla snížena na minimum. Cenou, kterou za to EU zaplatila, je, že většina výzkumu v moderních terapiích se po roce 2009 odehrává ve Spojených státech amerických a v Číně.

Budoucnost patří genové terapii

Historie moderní genové imunoterapie začala před více než 20 lety (1980, Carl June) výzkumem možností, jak uměle spustit cytotoxickou reakci T lymfocytů pomocí uměle zkonstruovaných buněčných receptorů vnesených do buňky metodami genového inženýrství. První experimenty s touto technologií byly namířeny jednak proti viru lidského imunodeficitu (HIV), kde však u pacientů neprojevily podstatný efekt a byly vytlačeny moderními léky, a dále proti pevným nádorům – jen s hraniční účinností. Průlom nastal až při pokusu o léčbu B buněčných leukemií: maligní buňky těchto leukemií nesou na povrchu receptor označovaný jako CD19. První pacient léčený genově manipulovanými T buňkami naprogramovanými na rozeznání a likvidaci buněk nesoucích antigen CD19 téměř zemřel – ale když se uzdravil, po malignitě doslova (jak uvádějí autoři) nebylo ani stopy, neboť nádorová tkáň se rozpadla [14].

Technologie tzv. chimérických antigenních receptorů a první výsledky léčby pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií byly publikovány v roce 2011 a jednalo se o první léčivý přípravek moderní terapie (léčivý přípravek, jehož součástí jsou živé buňky pacienta), který získal celosvětové uznání. Hned dvě farmaceutické společnosti (Novartis a Kite Pharma) významně zainvestovaly stamiliony dolarů do patentů, know how a lidí spojených s vývojem těchto buněk a v roce 2017 byly na trh uvedeny dva léčivé přípravky pro terapii B buněčných leukemií (Kymriah, Novartis; Yescarta, Kite Pharma). V roce 2019 byly tyto léčivé přípravky genové terapie registrovány i v EU [15].

Výroba těchto přípravků nás nepřekvapí – začíná leuk­afe­ré­zou, při které jsou od pacienta separovány lymfocyty z periferní krve. Vak s leukaferetickým produktem je poté transportován do výrobního závodu dané farmaceutické společnosti, kde je do buněk působením vhodných uměle vytvořených virů vnesena informace nezbytná k tomu, aby T lymfocyty v cytoplazmě vytvořily a na membráně vystavily receptorovou molekulu – chimérický antigenní receptor rozeznávající antigen CD19. Takto vytvořené genově modifikované buňky jsou vyčištěny od příměsí, zmrazeny v tekutém dusíku a odeslány zpět do zdravotnického zařízení k aplikaci. Jedinou nevýhodou je zde cena léku, která se počítá v desítkách milionů korun, a velmi široké spektrum nežádoucích účinků, jež se objevují při léčbě.

Ohromný úspěch buněk s chimérickými antigenními receptory v léčbě leukemie pak přitáhl celosvětovou pozornost vědců k imunoterapii hematoonkologických onemocnění. Stále se objevují a v klinických hodnoceních testují nové cíle pro tuto moderní protinádorovou léčbu a vyvíjejí se nové metody genového inženýrství (jako třeba CRISPR/Cas9) pro přesněji cílené genové manipulace. Imunoterapie hematoonkologických onemocnění dnes doplňuje standardní léčbu a biologickou terapii a její přínos pro pacienty je již nezpochybnitelný.